美洲鲥鱼嗜水气单胞菌病原的分离与鉴定

2021年，山东省临沂市一养殖场养殖的美洲鲥鱼(Alosa sapidissima)突发疾病并出现严重死亡，日死亡率高峰期达到2.5%，累积死亡率约为90%。患病鱼主要症状为体表出血、溃疡，解剖可见腹腔腹水、肝脏暗红，并伴有肠炎。组织病理学检测发现，病鱼肝脏出现弥散性坏死，嗜碱性粒细胞增多和细胞肿胀空泡变性；脾脏出现出血性贫血性坏死灶、核破裂和核固缩；肾脏淋巴细胞坏死脱落，肾小体毛细血管球萎缩，近端小管和远端小管内的细胞出现不同程度的细胞结构消失。发病鱼肉眼和显微镜观察未见明显寄生虫，利用PCR方法检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2)、鲈鱼蛙病毒(largemouth bass ranavirus)等淡水鱼类常见病毒均为阴性。细菌分离培养结果显示，从发病鱼的肝脏、肾脏和脾脏中分离得到形态一致的优势菌，命名为AS-AH2101。经16S rRNA测序比对和生理生化鉴定，确定AS-AH2101为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。毒力基因检测结果显示，AS-AH2101携带气溶素(aerA)、溶血素(hlyA)、丝氨酸蛋白酶(ahpA)、热稳定细胞肠毒素(ast)、热敏感细胞肠毒素(altA)和密度感应系统(luxS)基因。人工感染实验结果显示，AS-AH2101能引起蓝曼龙(Trichogaster trichopterus)发病死亡，半数致死量为3.23×104 CFU/尾。药物敏感性研究表明，AS-AH2101对头孢拉啶、阿莫西林、氨苄西林和红霉素等4种抗生素具有耐药性，对四环素和多西环素等11种抗生素敏感。综上所述，本研究报道了我国养殖美洲鲥鱼感染嗜水气单胞菌的典型病例，为美洲鲥鱼在我国养殖过程中的疾病防控以及嗜水气单胞菌病的防治提供了参考和借鉴。     

口服特异性卵黄抗体对凡纳滨对虾抗WSSV感染的免疫保护效果

为探讨特异性卵黄抗体对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的免疫保护机制及效果,本研究以添加不同剂量WSSV卵黄抗体制剂(0、0.2%和0.5%)的饲料投喂凡纳滨对虾幼虾,免疫28 d后使用WSSV进行人工感染,测定感染对虾的肝胰腺免疫酶活力和免疫基因表达水平,以及感染后14 d内对虾的存活率。结果显示,WSSV感染3 d后,与未添加卵黄抗体制剂的对照组相比,0.2%免疫组对虾肝胰腺的超氧化物歧化酶(SOD)和酚氧化酶(PO)活力显著升高,酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活力显著降低,热休克蛋白70基因(Hsp70)表达水平显著升高,凝集素基因(lectin)和β-1,3-葡聚糖结合蛋白–脂蛋白基因(β-GBP-HDL)表达水平显著降低;0.5%免疫组对虾肝胰腺的SOD活力显著升高,ACP和AKP活力显著降低,Hsp70基因表达水平显著升高,β-GBP-HDL基因表达水平显著降低。人工感染实验结果显示,WSSV感染14 d后,0.2%和0.5%免疫组对虾的存活率分别为48.89%和87.78%,均显著高于对照组(存活率为0),且0.5%免疫组对虾存活率显著高于0.2%免疫组。特异性卵黄抗体制剂能在一定程度上改变发病的进程,延迟对虾的发病和死亡时间,提高同期存活率。研究表明,口服特异性卵黄抗体制剂可以调节对虾肝胰腺免疫酶活力和免疫基因表达水平,显著提高凡纳滨对虾抗WSSV感染的能力。本研究为卵黄抗体抗WSSV感染机制的研究提供了参考,也为在生产上使用卵黄抗体防控WSSV感染提供了科学依据。     

不同养殖密度对中国明对虾生长和能量代谢的影响

本研究采用网箱养殖的方法,通过室内28 d的养殖实验,在4个养殖密度G1(100尾/ m3)、G2(200尾/m3)、G3(300尾/m3)、G4(400尾/m3)组中,研究不同养殖密度对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)生长、能量代谢和代谢酶活力的影响。结果显示,G2组的增重率(WGR)、相对增长率(AGR)和特定生长率(SGR)均最高,与G1组相比差异不显著(P>0.05);G3和G4组的体重差异系数(CVW)显著升高(P<0.05),其他生长指标和成活率(SR)均显著低于G1组(P<0.05);G4与G1组相比差异极显著(P<0.01)。随着养殖密度的增加,G3和G4组显著提高了血淋巴葡萄糖(Glc)、乳酸(LA)、丙酮酸(PA)的含量(P<0.05),显著降低了甘油三酯(TG)的含量(P<0.05);G2组4种指标含量与G1组相比差异不显著(P>0.05),而氨基酸含量在不同养殖密度之间变化不显著(P>0.05),表明在密度胁迫下,高密度对能源的需求增加,中国明对虾倾向性利用糖类脂类作为能源。另外,G3和G4组的己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、6-磷酸果糖激酶(6-PEK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性均显著升高(P<0.05),说明机体氧化代谢途径发生变化,分解代谢增强。琥珀酸脱氢酶(SDH)活性显著降低(P<0.05),表明三羧酸循环活性的降低,进一步表明密度胁迫抑制了组织的有氧代谢。研究表明,G3和G4组养殖密度显著影响了中国明对虾的生长,增加了碳水化合物和脂类利用,抑制了组织的有氧代谢。当中国明对虾为4.5 g时,其养殖密度100~200尾/m3为宜。     

一起条斑紫菜拟油壶菌病的诊断

赤腐病(red rot disease)和拟油壶菌病(Oplidiopsis disease)是海上栽培紫菜(Pyropia)的主要病害,常引起紫菜大面积病烂。2019年1月江苏省盐城市大丰区某条斑紫菜(Pyropia yezoensis)栽培海区有134 hm2发生了紫菜病烂,本研究对该起病烂进行了病害调查和病原鉴定。结果显示,患病紫菜的病症与拟油壶菌病一致,主要表现为发病初期,在叶片边缘、基部和中部出现粉红色的病斑,随着病程发展,病斑逐渐褪色并扩大;发病后期,整个叶片颜色变浅,叶片组织溃烂脱落;在显微镜下可观察到紫菜细胞内寄生1~4个圆球状菌体,菌体内有多个油滴状物质。以病烂紫菜叶片或其匀浆液为感染源,分别在10℃和20℃条件下进行人工感染实验,二者均能使正常紫菜出现拟油壶菌病的病症。对现场采集及人工侵染后的病烂紫菜疑似病原进行cox1基因测序和系统发育学分析。研究表明,所测cox1基因均与紫菜拟油壶菌(Oplidiopsis porphyrae、O. pyropiae、O. porphyrae var. koreana)聚为一支,相似度为100%。综上所述,该起条斑紫菜的病烂由紫菜拟油壶菌(Oplidiopsis sp.)引起。     

虾类行动障碍野田村病毒(MDNV) TaqMan RT-PCR检测方法的建立与应用

基于虾类行动障碍野田村病毒(movement disorder nodavirus, MDNV)的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因设计寡核苷酸引物和探针,以含有MDNV靶基因的pMD18-MDNV质粒和RNA标准品为模板,通过优化反应体系和反应程序,建立了MDNV的TaqMan RT-PCR检测方法。优化后的反应组分：20.0 μL TaqMan RT-PCR反应液预混液中包含11.0 μL一步法RT-PCR缓冲液、0.8 μL酶混合物、0.3 μmol/L正向引物、0.3 μmol/L反向引物、0.4 μmol/L探针、1.0 μL模板和5.2 μL RNA-free H2O;优化后的反应程序：54.5℃ 15 min,95℃ 1 min;45个热循环扩增(95℃ 10 s,60.3℃ 30 s)。本研究所建立的方法能实现对MDNV的特异性检测,在1.4×1010~1.4×101 copies/μL标准质粒浓度范围内,起始模板浓度对数值与反应循环数间呈良好的线性关系;该方法最低可检测5.5×101拷贝的RNA标准品或1.4×101拷贝的pMD18-MDNV标准质粒。分析结果还显示,该检测方法批内Ct值和批间Ct值的变异系数(CV)分别小于1.27%和1.83%,具有良好的重复性和稳定性。利用该方法对2019年采自我国部分省市的样品进行检测发现,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中MDNV的阳性检出率为23.5% (16/68)。本研究建立的MDNV TaqMan RT-PCR方法具有特异性、快速和灵敏等特点,可为对虾养殖实践中MDNV的定性、定量检测与监测以及有效防控提供技术支持。     

江苏高邮罗氏沼虾池塘养殖可培养微生物组成调查

为了探明罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)池塘养殖环境中重要微生物的组成, 以提升健康养殖管理技术, 分别于 2019 年 7 月、8 月和 10 月, 在江苏高邮市罗氏沼虾主养区开展了罗氏沼虾池塘养殖系统可培养环境微生物的组成调查。采用 LB 培养基分离纯化了罗氏沼虾肝胰腺、肠道、鳃及养殖水体中可培养的细菌, 利用细菌 16S rRNA 基因分子鉴定技术对分离菌株进行初步鉴定; 采用高通量测序技术分析了“铁壳”虾(养殖期生长缓慢)及铜绿微囊藻暴发池塘水环境微生物群落组成。以达卡气单胞菌(Aeromonas dhakensis)为受试病原菌, 分析了池塘养殖系统中潜在病原拮抗菌的种类及效果。3 次调查共分离可培养细菌 605 株, 成功鉴定 601 株, 分别属于 37 个属 119 种, 其中罗氏沼虾体内分离到菌株 23 属 76 种, 养殖水体中分离到 28 属 81 种。确定了池塘养殖系统中存在气单胞菌(Aeromonas spp.)、肠杆菌(Enterobacter spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)、弧菌(Vibrio spp.)等属的潜在病原菌。发生“铁壳”虾症的虾池优势环境微生物种类组成及占比与健康虾池相近, 但微小杆菌属(Exiguobacterium)与不动杆菌属(Acinetobacter)细菌占比高于健康虾池。铜绿微囊藻暴发影响环境微生物的组成结构, 嗜水气单胞菌属细菌占比增大。从池塘养殖系统筛选到甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、贝莱斯芽孢杆菌 (B. velezensis)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)等潜在益生菌对气单胞菌具有较强拮抗作用。调查结果可为掌握罗氏沼虾池塘养殖系统细菌性病原组成及建立防控技术提供理论依据。     

杀鱼假交替单胞菌2515的抗弧菌效果及在对虾养殖中的应用

为探讨一株杀鱼假交替单胞菌 2515 Pseudoalteromonas piscicida (简称菌株 2515)在对虾养殖中的抗弧菌效果, 以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)为指示菌, 以鳗弧菌的敏感抗生素新霉素为参比, 采用牛津杯打孔法, 比较了菌株 2515 与抗生素抗菌等效关系。设置浓度分别为 10⁴ CFU/mL、10⁵ CFU/mL、10⁶ CFU/mL、10⁷ CFU/mL 的菌株 2515 与鳗弧菌共培养, 评价了该菌对鳗弧菌的拮抗效果。将含量 10³ CFU/g、10⁵ CFU/g、10⁷ CFU/g, 及 10³ CFU/mL、 10⁵ CFU/mL、10⁷ CFU/mL 的菌株 2515 分别添加到对虾饲料和养殖水体中, 养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei), 分析了菌株 2515 对水体和对虾肠道细菌总数、弧菌数及对抗副溶血弧菌效果的影响。结果显示, 相同抗鳗弧菌效果条件下菌株 2515 数量与新霉素质量存在对应关系, 与鳗弧菌混合培养时, 浓度 10⁶ CFU/mL 及 10⁷ CFU/mL 的菌株 2515 对鳗弧菌表现出强的抑菌作用。饲料中添加菌株 2515 浓度 10⁵ CFU/g 及 10⁷ CFU/g 时能够显著降低对虾肠道中的弧菌数量(P < 0.05), 提高对虾养殖的存活率。采用副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)攻毒, 显示在饲料中添加菌株 2515 浓度为 10⁵ CFU/g 一组对虾死亡率最低, 为(43.3±5.8)%, 对副溶血弧菌的相对保护率达(53.7±6.2)%。结果表明, 在饲料和养殖水体中添加适宜浓度的菌株 2515 均能够提高凡纳滨对虾抗副溶血弧菌的能力, 降低对虾肠道内的弧菌数量。本研究结果为对虾养殖弧菌病生物防控提供了一种技术支撑。     

抗弧菌杀鱼假交替单胞菌2515的潜在毒性及热处理脱毒后抗菌效果

为评估一株具有弧菌拮抗功能的杀鱼假交替单胞菌2515 Pseudoalteromonas piscicida 2515 (以下简称"菌株2515" ) 对海水养殖动物的毒性, 并确定一种有效的热处理脱毒方法, 在中国明对虾Fenneropenaeus chinensis育苗水体中分别添加浓度为105、 106、 107、 108 CFU/mL的菌株2515, 测试其对中国明对虾受精卵孵化及幼体发育的影响.结果表明: 水体中添加浓度高于105 CFU/mL的菌株2515后, 显著降低了无节幼体变态发育至蚤状幼体的成活率 (P<0. 05); 分别应用血平板及显微观察法测试菌株2515对羊、鱼及对虾血细胞的溶血活性, 结果显示, 该菌对羊及鱼红细胞均具溶血活性, 而对凡纳滨对虾 Litopenaeus van-namei血细胞无溶血活性; 设置不同温度 (40、 45、 50、 55、 60、 65、 75℃) 热处理菌株2515及其破碎液,结果显示, 55 ℃ 1 h能够灭活该菌, 且失去对鱼类红细胞的溶血活性, 而抑菌物质活性可提高55. 8%.研究表明, 菌株2515对鱼虾具有潜在毒性, 选择适当热处理, 既能灭活溶血活性还可提高抗菌活性.     

养殖环境及贝源溶藻弧菌MLST分型及其毒力基因、耐药性分析

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是近年来贝类病害中最常见的细菌性病原之一，对贝类养殖产业的健康发展构成严重威胁。本研究旨在分析不同养殖环境水体和贝类组织中，溶藻弧菌的基因变异、毒力基因、耐药性及其分布规律。对12株溶藻弧菌分离株开展多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)、毒力因子以及菌株耐药性分析，结果显示，12株溶藻弧菌的序列型(sequence typing, ST)分型互不相同，7株为PubMLST数据库已经收录的ST型，5株因管家基因的等位基因位点变化而形成新的ST型，贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有较高的遗传多样性。12株溶藻弧菌都携带tlh、fur和collagenase三种毒力基因，但均未检测到tdh、trh、toxR和tcpA毒力基因。溶藻弧菌携带毒力因子的种类和数量受地区分布等因素的影响。不同来源的溶藻弧菌均具有多重耐药特征，对青霉素和氨苄西林产生抗性。本研究表明，贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有种群复杂、遗传多样性高的特点；不同来源菌株在毒力基因携带和耐药性方面存在较大差异。本研究通过探究不同区域内不同来源的溶藻弧菌遗传变异及耐药性差异，对贝源溶藻弧菌的有效防控提供一定理论参考。     

克氏原螯虾病原菌感染发病标志性免疫及生理生化指标的筛选

为筛选克氏原螯虾(Procambarus clarkia)因受病原菌感染导致发病的标志性生理生化指标, 以嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila)为攻毒菌株, 采用半致死剂量注射感染克氏原螯虾, 分析了感染初期(12 h)、发病期(24~72 h)和感染后恢复期(90 h)血淋巴中的非特异免疫、糖类代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及常规生理生化指标共 23 项, 结果显示, 在发病期, 8 项非特异免疫指标中, 感染组过氧化氢酶(CAT)活力和总抗氧化能力(T-AOC)在发病状态下提高显著(P＜0.01), 均值分别是空白对照组的 3.29 倍和 2.56 倍; 感染组发病期蛋白代谢指标白蛋白(ALB)和尿素(UREA) 浓度极显著提高(P＜0.01), 其浓度均值比空白对照组分别提高了 1.75 与 5.58 倍; 感染组发病期消化酶指标中淀粉酶(AMY)活力在发病过程中活性显著下降(P＜0.01), 比空白对照组下降了 74.18%; 血清中肌酸激酶(CK)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 4 种酶活力在发病期显著提高(P＜0.01), 与空白对照组比分别提高了 16.72、219.21、74.43、2.66 倍。在所检测指标中, 葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总蛋白(TP)和脂肪酶(LPS) 4 项指标在克氏原螯虾发病过程中均变化不显著(P＞0.05)。结果表明, 克氏原螯虾血清中 CAT、T-AOC、 ALB、UREA、AMY、CK、ALT、AST 及 GSH-Px 9 项指标变化对细菌感染发病极敏感, 可作为判断其受细菌病感染发病的标志性指标。本研究结果可为克氏原螯虾患病风险评估和疾病预警提供新的技术依据。